寒冬12月单核转录组文章集锦：找点时间找点空闲，看看别人都研究了啥！

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新年伊始，万物更新。在科研的道路上也是新文章新技术如雨后春笋般不断涌现。单核转录组是基于单细胞转录组的进一步升华，也是一项即将走向前沿热潮的新技术。关于该技术的应用和推广，在实时发表的新文章中走向了更广阔的的天和地。在已经过去的寒冬12月中，有哪些文章利用该技术走向了前沿阵地，让我们找点时间找点空闲，一起看看7篇文章中，别人都研究了啥。

文章一：新的大脑区域是如何进化出来的？ 

Cerebellar nuclei evolved by repeatedly duplicating a conserved cell-type setdoi: 10.1126/science.abd5059. 文章概论：

复杂的大脑是如何从简单的电路进化而来的？在这里，作者研究了小脑核(小脑的输出结构)在细胞类型分辨率下的脑区进化。利用小鼠、鸡和人的单核RNA测序，以及STARmap空间转录分析和全中枢神经系统投影追踪，作者鉴定了一个保守的细胞类型集合，包含两个区域特异性兴奋神经元类别和三个区域不变抑制神经元类别。这一组构成了一个原型小脑核，它被重复复制以形成新的区域。在大量扩张的人类外侧核中，优先将信息输送到小鼠外侧额叶皮质的兴奋性细胞类占主导地位。这项研究展示出一个通过整个细胞类型集合的复制和分化而形成的大脑区域进化模型。

 文章亮点：

• 史上首次在细胞类型精度上揭示大脑的进化机制
  

• 以小脑神经核为实验对象，研究其从鱼到哺乳类的演化过程

• 运用单细胞测序和空间转录组分析，发现小脑神经核在组织和进化上有一个元单位

• 小脑神经核通过对元单位内的全部细胞类型进行复制和歧变从而实现进化

单核转录组实验材料：

8-12周大的雄性C57BL/6J小鼠；成年(~20周龄)公鸡作为家禽疾病与肿瘤学实验室(ADOL)6×7系杂交的F1后代；死于癌症的患者：捐赠者H1和捐赠者H3是65岁的白人男性，捐赠者H2是一名39岁的黑人女性

后续验证：Patch-Seq，STARmap原位测序 小脑核团的进化左上：小鼠、鸡和人类的单细胞比较转录图谱；右上: 小鼠和鸡的空间转录分析；左下: 小鼠中枢神经系统(CNS)范围的投影图谱；红色方框: 三个抑制性神经元和两个兴奋性神经元。

文章二：单核RNA-seq鉴定多核骨骼肌纤维的转录异质性 

Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibersdoi: 10.1038/s41467-020-20063-w. 文章概论：

虽然大多数细胞只有一个核，但滋养层细胞、破骨细胞和骨骼肌纤维等细胞类型需要多核。多核的一个优点是可以将不同的功能分配给不同的细胞核，但由于存在共同的细胞质，对多核组织内转录异质性的全面询问一直是具有挑战性的。在这里，作者利用单核RNA测序(snRNA-seq)来确定多核骨骼肌纤维内转录多样性的程度。来自小鼠骨骼肌的细胞核在整个生命周期中被描绘出来，这表明在出生后发育和衰老的肌肉中出现了不同的肌核群体。作者的数据集还为发现与肌肉细胞罕见的特殊区域相关的基因提供了一个平台，包括肌腱连接的标记和在神经肌肉连接表达的功能验证因子。这些发现表明，合体肌纤维内的肌核具有调节肌肉生物学的不同转录特征。

 单核转录组实验材料：选取出生后第10天、第21天、5月龄、24月龄和30月龄，安乐死后立即分离小鼠胫骨前肌或比目鱼肌进行提核
实验平台：10X Genomics
后续验证：单分子RNA荧光原位杂交，qRT-PCR 图1 部分结果展示左图：小鼠骨骼肌细胞核纯化和测序示意图；右图：对出生后第10天、第21天、5月龄、24月龄和30月龄胫骨前肌的snRNA-seq数据进行UMAP综合分析。

文章三：CoolMPS用于液滴法捕获的单核RNA的稳健测序 

CoolMPS for robust sequencing of single-nuclear RNAs captured by droplet-based methoddoi: 10.1093/nar/gkaa1127. 文章概论：

大规模平行单细胞和单核RNA测序(scRNA-seq，snRNA-seq)需要大量的测序，以实现每个细胞的适当覆盖，这使得测序资源和测序器的可用性成为进行深度转录图谱的关键因素。CoolMPS是一种新的合成测序方法，它依赖于可重复使用的抗体进行核苷酸标记，但它是否适用于snRNA-seq还没有得到测试。在这里，作者使用一种低成本的现成协议将广泛使用的Chromium 10X技术生成的库进行化学转换，使其可以使用CoolMPS技术进行排序。为了评估用CoolMPS测序的转换文库的质量和性能，作者从年轻和老年小鼠的海马中生成了一个snRNA-seq数据集。文库在Illumina Novaseq上测序，转换为与CoolMPS兼容的文库在DNBSEQ-400RS上测序。CoolMPS衍生数据忠实地复制了原生文库数据集的关键特征，包括环境RNA污染的正确估计、捕获细胞的检测、细胞群集结果、空间标记基因表达、复制间和复制内差异以及老化过程中基因表达的变化。总之，作者的结果表明，CoolMPS为基于液滴的文库中RNA的标准测序提供了一种可行的替代方法。

 单核转录组实验材料：老年C57BL/6J雄性野生型小鼠(18月龄)和青年C57BL/6J小鼠(3月龄)，从整个海马体中分离出细胞核
实验平台：10X Genomics
后续实验：进行文库转换和CoolMPS测序 图1 部分结果展示图A：实验流程，从两只幼龄(3月龄)和两只老龄(18月龄)小鼠的海马区构建了4个10X的snRNA-seq文库。分别使用Illumina Novaseq和DNBSEQ-400RS进行测序。图G和H：UMAP图，图中代表了在(G)原生库数据集中和(H)转换库数据集中分别带细胞类型注释的细胞

文章四：利用单核RNA-seq验证特发性肺纤维化中MUC5B相关的变异体 

The MUC5B-associated variant, rs35705950, resides within an enhancer subject to lineage- and disease-dependent epigenetic remodelingdoi: 10.1172/jci.insight.144294 文章概论：

rs35705950是位于MUC5B起始点上游约3kb的G/T颠倒事件形成的变异体，它是特发性肺纤维化(IPF)的主要危险因素。在这里，作者研究了这个MUC5B-3kb区域的功能和染色质结构，并提供了证据表明它作为经典定义的增强子受到表观遗传编程的影响。作者用新转录本分析结果表明RNA聚合酶II发生在G/T颠换位点的10bp内，形成了该区域的增强子功能。通过ATAC-seq分析新鲜和培养的人气道上皮细胞的染色质可及性数据，证明该区域位于可及性染色质中，影响MUC5B的表达。利用成对的单核RNA-seq和单核ATAC-seq应用于IPF肺的冰冻组织，作者将这些发现直接扩展到疾病，结果表明IPF中MUC5B-3kb增强子的表观遗传编程，在表达MUC5B和不表达MUC5B的细胞系中都存在。综上所述，该研究结果表明，MUC5B相关的变异体体rs35705950存在于一个增强子中，该增强子容易发生表观重塑，并导致IPF的病理性错误表达。

 单核转录组实验材料：用于单核分析的肺组织来自因多种适应症(结节、结构畸形、反复感染)接受活组织检查的患者
实验平台：10X Genomics
辅助测序：snATAC-seq ，PRO-seq，ATAC-seq
后续验证：ChIP-qPCR，qRT-PCR， MNase-qPCR 

snRNA-seq和snATAC-seq数据的UMAP聚类图

图A：IPF患者和对照组的肺组织snRNA-seq数据的UMAP聚类图图B：利用来自成对snRNA-seq的基因表达信息，IPF和对照组肺的snATAC-seq数据的UMAP聚类图 表观启动和正反馈模型图：(A)MUC5B-3kb增强子的碱基定位核小体包装。(B)在多效性刺激下，发生染色质重塑，启动增强子DNA与转录因子的相互作用。(C)在纤维化肺疾病的背景下，增强子被一系列转录因子激活，这些转录因子通过STAT、ETS和Forkhead box家族成员的半退化结合位点作用，导致RNAPII的招募和诱导MUC5B的表达。(D)MUC5B的表达反过来促进内质网应激和粘液纤毛功能障碍，导致相邻细胞中MUC5B的额外激活，从而构成一个正反馈电路。

文章五：单核转录组学揭示合体骨骼肌细胞的功能区划分 

Single-nucleus transcriptomics reveals functional compartmentalization in syncytial skeletal muscle cells

doi: 10.1038/s41467-020-20064-9.

文章概论：

合体骨骼肌细胞在同一细胞质中含有数百个细胞核。作者利用从肌肉纤维中分离出的细胞核进行单核RNA测序(snRNAseq)，研究了未损伤和再生肌肉中的核异质性和转录动力学。这揭示了与纤维类型多样性无关的不同的核亚型，和以前未知的亚型以及在神经肌肉和肌腱连接处预测的亚型。在Mdx营养不良小鼠模型的纤维中，也出现了不同的亚型：发现表达修复信号的细胞核也在营养不良患者的肌肉中大量存在，还有与坏死纤维相关的核群体。最后，作者对手术方法的改进揭示了罕见的、特化的肌梭的区域化。研究数据确定了肌纤维的核区，并为其功能分析定义了一个分子路线图；这些数据可以在MyoExplorer服务器(https://shiny.mdc-berlin.de/MyoExplorer/)上自由浏览。

单核转录组实验材料：

对于未受伤的、再生的胫前肌(分别为7和14天)和Mdx肌肉，分别从两只小鼠中汇总了两块TA（胫前肌）肌肉(每只小鼠一块TA)

实验平台：

CEL-Seq2

后续验证：

单分子FISH，WB，RT-qPCR 

未损伤和再生肌肉中的核异质性

颜色表示未损伤或再生肌肉中不同的核群(左)或核（右）

文章六：间歇性缺氧下小鼠内脏脂肪在单细胞水平的转录组变化 

Transcriptomic Changes of Murine Visceral Fat Exposed to Intermittent Hypoxia at Single Cell Resolution

doi: 10.3390/ijms22010261.

文章概论：

间歇性低氧(IH)是阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)的特征，可导致内脏白色脂肪组织(vWAT)出现炎症、脂解增加和胰岛素抵抗等代谢功能障碍。然而，这些功能紊乱背后的细胞类型及其相应的转录途径尚不清楚。在这里，作者应用单核RNA测序(snRNA-seq)和RNA-seq相结合的方法来评估模拟阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(IH)暴露后vWAT中细胞的异质性。C57BL/6雄性小鼠暴露于IH和室内空气(RA)中6周后，分离vWAT细胞核，进行snRNA-seq分析、细胞类型差异表达基因(DEGs)分析以及有意义的基因通路富集注释。与RA相比，在vWAT中鉴定的14种不同细胞类型中，IH诱导了显著的转录变化。作者确定了vWAT中的细胞特异性标志物、转录网络、代谢信号通路和细胞亚群富集。在全基因组范围内，作者还在多种细胞类型中识别了298个与代谢途径相关的共同调控基因。使用RNA-seq对vWAT中的细胞类型进行去卷积显示，不同的脂肪细胞似乎在代谢功能障碍的关键方面存在差异。因此，vWAT的异质性及其在细胞水平对IH的反应为了解阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSA)的代谢性发病率提供了重要的见解，并可能转化为治疗靶点。

单核转录组实验材料：

非肥胖C57BL/6雄性小鼠, 暴露于IH和室内空气(RA)中6周后，分离vWAT细胞核，进行snRNA-seq分析

实验平台：

10X Genomics

辅助测序：

RNA-seq，qRT-PCR 

图1.小鼠外周脂肪组织(vWAT)的单核转录分析(snRNA-seq)

图A：snRNA-seq和批量RNA-seq实验设计

图B：暴露于RA的小鼠vWAT的UMAP聚类图

图C：暴露于IH的小鼠vWAT中的UMAP聚类图

图D：RA中每种细胞类型的top5的基因热图

图E：RA和IH中每种细胞类型的top5的基因热图

文章七：附睾脂肪组织在单核分解时对饮食诱导的肥胖反应的可塑性

Plasticity of Epididymal Adipose Tissue in Response to Diet-Induced Obesity at Single-Nucleus Resolution

doi: 10.1016/j.cmet.2020.12.004.

文章概论：

脂肪组织表现出显著的适应饮食状态的能力。在这里，作者应用单核RNA-seq技术在单核分辨率下定位小鼠附睾白色脂肪组织的可塑性，以响应高脂饮食诱导的肥胖。单核方法使作者能够检测所有主要的细胞类型，并揭示从前脂肪细胞承诺到成熟脂肪细胞的整个成脂轨迹上不同的转录阶段。作者证明了不同脂肪细胞亚群的存在，并表明肥胖会导致生脂亚群的消失和应激清除脂质亚群丰度的增加。此外，肥胖与其他细胞群体的丰度和基因表达的重大变化有关，包括巨噬细胞中脂质处理基因的急剧增加，而巨噬细胞特异性基因的牺牲。这些数据为未来以假说为导向的脂肪细胞分化和脂肪组织可塑性机制的研究提供了有力的资源。

文章亮点：

• 单核RNA-seq揭示了脂肪组织中所有主要细胞类型的细胞核
  

• HFD-诱导的肥胖诱发大多数脂肪细胞类型的炎性基因程序
  

• 在hfd诱导的肥胖中生脂脂肪细胞亚群丢失

• 体内脂肪形成的轨迹显示出不同的转录阶段

单核转录组实验材料：

雄性C57BL/6JBomTac小鼠：10周龄小鼠喂饲高脂饮食(以诱导肥胖发展，而对照组给予低脂饮食18周(实验1和2)或22周(实验3)。对于实验1和2，来自三只小鼠的eWAT被混在一起进行核分离和snRNA-seq实验；对于实验3，使用一只小鼠的eWAT进行细胞核分离和snRNA-seq实验

实验平台：

10x Genomics

后续验证：

组织学染色，成熟脂肪细胞免疫荧光染色

 图1.部分结果展示

图A：附睾脂肪组织的snRNA-seq工作流程

图B：小鼠平均体重

图C：小鼠平均血糖

图D：小鼠平均组织重量

图E：小鼠三色染色eWAT的代表性切片

图F：eWAT细胞类型的UMAP聚类图

图G：特定细胞类型的标记基因热图

图H：瘦小和肥胖小鼠的eWAT细胞类型的UMAP聚类图

图I：每种细胞类型的平均占比

总结

综上所述单细胞核技术已经被越来越多科研工作者所关注，也陆续发表一些研究成果，这些研究广泛应用于多个物种（人、小鼠、大鼠、鸡），多种样本类型（脑组织、骨骼肌、海马组织、肺脏组织、脂肪、睾丸等），并且适用冷冻组织，解决了单细胞转录组测序的局限。相信以上分享可以给老师带来单细胞核转录组技术领域研究一些启示，如果您对单细胞核转录组技术感兴趣，那就快快与我们取得联系，百迈客助您高速跨入2021单细胞核转录组技术体验！

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文：Tanbn&Anna

排版：市场部

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